اثر مهار کننده ها بر فعالیت انزیم ها

بسم الله الرحمن الرحیم

بررسی عوامل فزیکوشیمیایی بر فعالیت انزیم"

اثر مهار کننده ها بر فعالیت انزیم ها

گردآورنده

مهدی شیرکوند مقدم 

مقدمه

آنزیم:

آنزیم ها پلیمرهای بیولوژیکی هستند این پلیمرها واکنشهای شیمیایی را طوری کاتالیز می کنند که نتیجه ی آن ایجاد حیات به شکل موجود می باشد.

آنزیم هایی که تبدیل یک یا چند ترکیب(سوبسترا)را به یک یا چند ترکیب مختلف (محصولات)کاتالیز می کنند سزعت واکنش های مربوط را حداقل به میزان 106

برابر حالت بدون کاتالیزر افزایش می دهند.

آنزیم هاکاتابولیست هایی فوقالعاده انتخابی و اختصاصی هستند که دارای ویژگی های فضایی می باشند و این توانایی  به سلول زنده می دهند که به طور هم زمان طیف وسیعی از فرایند ها ی شیمیایی را هدایت نموده و به طود مستقیم کنترل می کنند.آنزیم ها را می تون به دو دسته تقسیم کرد:

1.  آنزیم هایی که فعالیت آنها فقط به ساختمان پروتئینی انها بستگی دارد .

2.  آنزیم هایی که برای فعالیت خود به ترکیبات غیر پروتئینی نیاز دارند.

در واکنش هایی شیمیایی که توسط آنزیم ها کاتالیز می گردد معمولا سه جسم شرکت دارند:

1. ماده ی اولیه یا سوبسترا

2. فعال کنندهی غیر پروتئینی + آنزیم یا آنزیم به تنهایی

3. محصول

آنزیم ها در طی واکنش  به   مصرف نمی رسند و بدون هیچ تغییری باقی می مانند.به طور طبیعی آنزیم ها در بافت ها هستند که بر اثر آسیب بافتی داخل خون می آیند و ممکن است شوک ایچاد کنند.

نام گذاری و طبقه بندی آنزیم ها:

برای نام گذاری آنزیمها قبلا لفظ ase را در آخر نام سوبسترا اضافه می کردند.

مثلا انزیمی که روی نشاسته تاثیر می گذارد آمیلاز و آنزیمی که روی اوره اثر می گذارد اورهاز می نامند. وقتی مشخص گردید بعضی انزیم ها شکل های متعددی دارند از حروف و اعدادی برای تمایز انها استفاده شد سپس برای حذف ابهامات اتحاد بین المللی بیوشیمی انزیم ها را بر حسب نوع واکنشی که کاتالیز مینمایند به 6 دسته اصلی تقسیم کردند که هر طبقه خود به چند گروه تقسیم می شوند به طوری که شناسایی یک آنزیم با 4 عدد شروع می شود :

1. عدد اول متعلق به نوع واکنش انزیم

2. اشاره به نوع کوآنزیم میکند.

3.عدد سوم دسته انزیم

4. شماره ردیف هر انزیم و نوع سوبسترا را مشخص می کند.

برای مثال در  الکل دهیدروژناز E:1111 است.

**در واکنش های تعادلی معمولا واکنشی که متداول تر است را در نظر می گیریم.

6دسته اصلی آنزیم عبارتند از :

1. اکسیدو ردوکتاز:باعث اکسیداسیون یک جسم (از دست دادن الکترون – پروتون و گرفتن اکسیژن) و احیا جسم دیگر می شوند.این انزیم ها اغلب دارای یک کوانزیم هستند.

2.ترانسفراز :عمل انتقال یک ریشه یا عامل شیمیایی را از یک جسم به جسم دیگر انتقال می دهند .برای مثال :هگزوکیناز باعث انتقال یک ریشه ی فسفریک از یک ملکول ATPبر روی هگزوز می گردد.

3.هیدرولاز:باعث هیدرولیز پیوندهای مختلف مانند پیوندهای پپتیدی و استری گلیکوزیدی می گردند که این عمل را با همراهی یک ملکول آب انجام می دهند.

4.لیاز :شکستن پیوندهایC-C,C-O ,C-N و سایر پیوندها را با باحذف اتمو بافی گذاشتن پیوندهای دوگانه کاتالیز  میکنند و انرژی خود را از ATPنمی گیرند و از شکستن پیوندها می گیرند.

5.ایزومراز :تغیرات هندسی  یا ساختمانی درون یک ملکول را کاتالیز می کنند.

6.لیگاز :اتصال دو ملکول را به هم توام با هیدرولیز ATP را کاتالیز می کنند.

سوبسترا باعث تغییر آرایش فضایی در انزیم ها می شود.

در اواخر قرن 19 امیل فیشر تناسب و هم شکلی بسیار اختصاصی بین انزیم ها و سوبسترا را با قفل و کلید مقایسه کرد درحالی  مدل پاسخ گوی اختصاصی بودن بی نظیر برهم کنش انزیم-سوبسترا می باشد اما انعطاف پذیری اشاره شده مربوط به جایگاه فعال انزیم و توجیه تغییرات دینامیکی حین کاتالیز رادر نظر نمی گیرد.

دانیل کوشلند با مدل قالب القا شده به این نقطه ضعف پرداخت این مدل بیان می کند وقتی سوبسترا به یک انزیم نزدیک شده و به ان متصل می شود تغییری در ارایش فضایی انزیم ها ایجاد می شود.

نتیجه ی منطقی این است که انزیم هم به نوبه خود تغییرات متقابل در سوبسترایش القا می کند و انرژی اتصالات را برای تبدیل سوبسترا  به محصول به کار می گیرد.

گروه های پروستتیک – کوفاکتورها و کوانزیم ها نقش های مهمی را در کاتالیزور بر عهده دارند.

همانطور که قبلا اشاره شد  بسیاری از انزیم ها حاوی ملکولهای غیر پروتئینی کوچک و یه یون های فلزی هستند که مستقیما در اتصال به سوبسترا یا فرایند کاتالیز شرکت می کنند این اجزا گروه های پروستتیک –کوفاکتور و کوانزیم نامیده می شوند.

*گروه ها یروستتیک بر اساس اتصال محکم و پایدار خود با ساختمان پروتئینی انزیم از طریق نیروهای کووالان و یا غیر کوالان مشخص می گردند فلزات جز معمول ترین گروهای پروستتیک هستند.تقریبا 3/1 تمامی انزیم ها حاوی یون های فلزی با اتصال محکم بوده و به همین دلیل انها را متالو انزیم می نامند.

از جمله این عوامل میتوان پیریدوکسال فسفات – تیامین پیروفسفات – بیوتین –FMN-FAD و یون های فلزی است.

*در حقیقت پروستتیک ها کوانزیم هایی هستند که محکم به سوبسترا متصل شده اند.

1.تیامین پیروفسفات TPPکه هز ویتامین B1مشتق و در واکنش های دکربوکسیلاز شرکت میکند.

2.فلاوین منونوکلئوتید FMN و فلامین ادنین دی نوکلئوتید FADهر دو از ویتامین B2یا ریبوفلامین مشتق و در واکنش های اکسیدوردوکتاز شرکت می کنند.

3.فسفات پیریدوکسال:از ویتامین B_{6یا پیریدوکسال مشتق می شود این کوآنزیم عمل انتقال عامل آمین از یک اسید آمینه}برروی یک اسید آلفا ستونیک را برعهده دارد.

4.بیوتین:از ویتامینHیابیوتین مشتق شده است و کوآنزیم آنزیم های کربوکسیلاز می باشد.

5.کوآنزیم تترا هیدروفوبیک اسیدTHF:از اسیدفولیک مشتق میشود و انتقال گروه کربونیل را برعهده دارد.

6.کوبالید:از ویتامینB₁₂ یاکوبالامین مشتق شده است ودرواکنش های آلکیلاسیون شرکت دارد.

7.نیکوتین آمید آدنین دی نوکلئوتیدNAD⁺]] ونیکوتین آمیدآدنین دی نوکلئوتیدفسفات NADP⁺]]که هردوازویتامین نیکوتین آمید مشتق شده اندودرواکنش های اکسیدوردوکتازشرکت می کنند.

کوفاکتورها به طور برگشت پذیر به آنزیم هاویاسوبستراها متصل می شوند.کوفاکتورها فعالیت هایی مشابه کروه های پروستتیک دارندولی به صورت موقتی وقابل تفکیک به آنزیم ها یاسوبستراهایی نظیرATP اتصال می یابند از این رو بر خلاف گروه های پروستتیک که دارای ارتباط محکم هستند کوفاکتورهارا باید درمحیط اطراف آنزیم برای کاتالیز وجود داشته باشند معمول ترین کوفاکتورها را یونهای فلزی تشکیل می دهند وآنزیمهایی که نیاز به یک کوفاکتور یون فلزی دارند را آنزیم های فعال شونده توسط فلز کوینده تا ازمتالوآنزیم ها تمایز داده شوند.

کوآنزیم هابه عنوان شاتل های سوبسترایی عمل می کنند.کوآنزیم ها به صورت شاتل های قابل چرخش- یا معرف های انتقال گروه-عمل می کنند که بسیاری ازسوبستراها را ازمحل تولی به محل مصرف آنها انتقال می دهند.علاوه براین اتصال به کوآنزیم منجر به پایداری سوبستراهایی نظیر اتم های هیدروژن یایونهای هیدریدی می گردد که درمحیط آبی سلول ناپایدار هستند.

بسیاری ازکوآنزیم ها وکوفاکتورهاوگروههای پروستتیک مشتقاتی ازویتامین هایBهستند که بدن انسان قادر به سنتز آنها نیست وبایدتوسط موادغذایی به بدن انسان برسند.

اما برخی از آنهانیزتوسط بدن ساخته می شوند:

الف)کوآنزیم های تتراپیرولی که ساختمانی شبیه هم دارند.

ب)اسید لیپوئیک

پ)کوآنزیمQ یااوبیکینون)ATP

*اگر یک آنزیم هم یون وهم کوآنزیم به آن وصل شده باشد به آن هولوآنزیم گفته می شود.

سینتیک آنزیمی

سینتیک آنزیمی عرصه ای در بیوشیمی است که با اندازه گیری کمی سرعت واکنشهای آنزیمی و مطالعه ی اصولی عوامل موثر در این سرعت ارتباط دارد .

وقتی آنزیم با سوبسترا ترکیب می شود چهار مرحله یا چهار فاز بوجود می آید:1_فاز تاخیری یا lag time :زمانی که طول میکشد تا سوبسترا جای خود را روی آنزیم  پیدا کند که در این فاز محصولی تولید نمیشود .

2_فاز درجه صفر :سوبسترا در جایگاهش قرار میگیرد که مقدار آن هم زیاد است در این مرحله بدلیل زیادی سوبسترا واکنش رفت غالب بر واکنش برگشت است در نتیجه محصولات خیلی زیاد نیست .

3_فاز مخلوط :مقدار محصولات زیاد میشود بطوری که خود محصولات نیز میتوانند بصورت سوبسترا عمل کنند و واکنش برگشت انجام شود .

4_فاز تعادلی :سرعت واکنش رفت با برگشت برابر است .

اثر عوامل مختلف بر سرعت آنزیم:

1_دما :افزایش دما سرعت واکنشهای شیمیایی را افزایش میدهد ولی در مورد واکنشهای آنزیمی دو اثر مختلف دارد .1_افزایش سرعت واکنشهای آنزیمی  2_بر هم زدن ساختمان پروتئینی آنزیم که موجب از بین رفتن فعالیت آنزیم میشود .با افزایش دما بیش از 50 درجه ساختمان پروتئینی آنزیم دگرگون میشود .

دمای ایده آل 

دمایی که در آن میزان فعالیت آنزیم حداکثر است که این دما برای اغلب آنزیمهای بدن انسان 37 درجه است .

2_ph:

Ph اپتیمم :ph ی که در آن هر آنزیمی بیشترین فعالیت را از خود نشان میدهد که اینph برای اکثر آنزیمها همان ph خون است به غیر از آنزیمهای معده (پپسین)که در  ph اسیدی فعالیت دارند و آنزیم کلین استراز که درph قلیایی عمل میکند .ph روی ساختمان برخی آنزیمها مثل پاپالین اثر ندارد .

3_غلظت سوبسترا :

با افزایش غلظت سرعت واکنش افزایش می یابد تا اینکه تمام مولکولهای آنزیم اشباع شوند بعد از آن افزایش غلظت دیگر اثری روی سرعت ندارد و سرعت مستقل از غلظت عمل میکند .منحنی سرعت بر حسب غلظت یک منحنی هایپرولیک است .در یک لحظه خاص تنها مولکولهایی از سوبسترا که به شکل کمپلکسES به آنزیم اتصال یافته اند میتوانند به محصول تبدیل شوند .

غلظت آنزیم :

سرعت یک واکنش آنزیمی تا زمانی که سوبسترا به مقدار کافی در محلول موجود باشد مستقیما متناسب با غلظت آنزیم میباشد ولی در صورتی که افزایش غلظت آنزیم ادامه یابد زمانی میرسد که دیگر سرعت واکنش به علت کمبود مقدار سوبسترا افزایش نمی یابد .

رابطه میکائیلیس و منتون :

میکائیلیس و منتون  فرمول زیر را برای محاسبه ی سرعت واکنش آنزیمی ارائه دادند .   

                                          V₀=V_m.(S)/K_m.(S)

وابستگی سرعت واکنش ابتدایی به s وk را می توان با ارزیابی معادله میکائیلیس و منتون در سه حالت بیان نمود :

1.وقتی   (S) بسیار کمتر از K_m باشد در نتیجه میزان  K_m+(S)    اساسا برابر K_m  می باشد که در نتیجه رابطه ی نامبرده به صورت مقابل خلاصه میگردد:                              V₀=V_m/K_m.(S)

پس نسبت آنان نیز ثابت است.

2. وقتی   (S) بسیار بیشتر از K_m باشد میزان   K_m+(S)   اساسا برابر (S)  میباشد که رابطه ی مزبور به صورت زیر خلاصه می شود :

                                         V₀=V_m                                                    

در این رابطه سرعت واکنش ابتدایی  حداکثر V_m   بوده وتحت اثر افزایش غلظت سوبسترا قرار نمیگیرد.

3.وقتی   S))=K_m   باشدV_m/2  که این معادله بیان میکند وقتی میزان   (S) برابر k_m  باشد سرعت ابتدایی نصف میزان حداکثر میباشد.

در نتیجه   K_m  را که ضریب ثابت میکائیلیس  میباشد را به این صورت تعریف میکنند:

K_m مقدار غلظتی است از سوبسترا که موجب پیدایش نصف سرعت حداکثر آنزیمی میگردد.

یا

K_m غلظتی از سوبسترا است که در این غلظت نیمی از نقاط فعال آنزیم توسط سوبسترا اشغال میشود.

K_m با میل ترکیبی آنزیم و سوبسترا رابطه ی عکس دارد .یک k_m بزرگ  نشان دهنده ی یک پیوند ضعیف  بین آنزیم و سوبسترا است . ویک k_m  کوچک نشان دهنده ی پیوند قوی بین آنزیم و سوبسترا میباشد.

یعنی طبق رابطه ی میکائیلیس و منتون میتوان گفت  : هر چه آنزیمی فعال تر بوده و میل ترکیبی آن با سوبسترا بیشتر باشد ،سرعت واکنش بیشتر و k_m کوچکتر است.

رابطه ی لینویور –برک :

اندازه گیری مستقیم   V_m     ومحاسبه ی  K_m  نیاز به غلظت های بالای سوبسترا دارد که برای رسیدن به شرایط اشباع غیر عملی است ،پس اگر رابطه ی میکائیلیس و منتون به صورت عکس نوشته شود ،تغییرات عکس سرعت واکنش ، برای عکس غلظت سوبسترا  به صورت یک خط مستقیم خواهد بود ، به طوری که محل برخورد این خط با محور عرضها نقطه ی   1/V_m و محل برخورد آن با محور طول ها نقطه ی  -1/K_m  می باشد و رابطه لینویور-برک عبارت است از:

1/V₀=k_m+s/V_m.s                        

در نتیجه محاسبه ی میزان k راحت خواهد بود در حالیکه در رابطه ی منتون و میکائیلیس اینگونه نبوده است.  

بررسی انواع ترکیب مهارکننده:

ترکیباتی که موجب افزایش سرعت واکنش های آنزیمی میشوند ،فعال کننده و ترکیباتی که موجب کاهش سرعت یا توقف واکنش های آنزیمی میشوند مهارکننده مینامند.

مهارشدن فعالیت آنزیم به این معنی است که در شرایط مناسب حرارت ، pH ،غلظت سوبسترا سرعت واکنش آنزیمی کاهش یابد .این پدیده یک تغییر شیمیایی است و با کم شدن فعالیت آنزیم در اثر دناتوره شدن که یک تغییر فیزیکی است ، تفاوت دارد.

انواع مهارکننده:

1.              مهارکننده هایی که عمل آنها برگشت پذیر است  که خود شامل سه دسته اند:رقابتی-نارقابتی-غیر رقابتی

انواع مهار کننده ها ی برگشت پذیر :

1_مهار کننده رقابتی :با سوبسترا برای اتصال به آنزیم رقابت میکند.این مهار کننده تنها به آنزیم آزاد Eاتصال میابد.لذا افزایش قابل توجه غلظت سوبسترا میتواند سبب حذف مهار کننده رقابتی گردد .در این حالتVmax ثابت میماند ولی Km افزایش میابد .اکثر مهار کننده های رقابتی ساختمانی مشابه  سوبسترای آنزیم دارند .

2_مهارکننده نارقابتی :تنها زمانی به آنزیم اتصال میابد که حتما از قبل سوبسترا  به آن اتصال یافته  باشد .این مهار کننده تنها به کمپلکس آنزیم _سوبسترا (ES)متصل میشود .در واقع برای اتصال مهار کننده ابتدا لازم است سوبسترا اتصال یافته  وبا ایجاد تغییر در ساختمان فضایی آنزیم ،امکان اتصال مهار کننده را فراهم سازد .در این حالت هر دو مقدار Vmax و Vm کاهش میابد .

3_مهار کننده غیر رقابتی :اتصال آن کاملا مستقل از اتصال سوبسترا میباشد ،به طوری که میتواند  به E یاES اتصال یابد در این حالت Vmax کاهش می یابد،ولی Km ثابت می ماند .

وسایل ازمایش

لوله ازمایش . محلول لوگول . .محلول نیترات جیوه  . محلول امیلاز . نشاسته..بن ماری

شرح کار

انواع مهارکننده:

1.              مهارکننده هایی که عمل آنها برگشت پذیر است  که خود شامل سه دسته اند:رقابتی-نارقابتی-غیر رقابتی

انواع مهار کننده ها ی برگشت پذیر :

1_مهار کننده رقابتی :با سوبسترا برای اتصال به آنزیم رقابت میکند.این مهار کننده تنها به آنزیم آزاد Eاتصال میابد.لذا افزایش قابل توجه غلظت سوبسترا میتواند سبب حذف مهار کننده رقابتی گردد .در این حالتVmax ثابت میماند ولی Km افزایش میابد .اکثر مهار کننده های رقابتی ساختمانی مشابه  سوبسترای آنزیم دارند .

2_مهارکننده نارقابتی :تنها زمانی به آنزیم اتصال میابد که حتما از قبل سوبسترا  به آن اتصال یافته  باشد .این مهار کننده تنها به کمپلکس آنزیم _سوبسترا (ES)متصل میشود .در واقع برای اتصال مهار کننده ابتدا لازم است سوبسترا اتصال یافته  وبا ایجاد تغییر در ساختمان فضایی آنزیم ،امکان اتصال مهار کننده را فراهم سازد .در این حالت هر دو مقدار Vmax و Vm کاهش میابد .

3_مهار کننده غیر رقابتی :اتصال آن کاملا مستقل از اتصال سوبسترا میباشد ،به طوری که میتواند  به E یاES اتصال یابد در این حالت Vmax کاهش می یابد،ولی Km ثابت می ماند .

عوامل فزیکوشیمیایی موثر در فعالیت انزیم ها به سه دسته میتوان تقسیم کرد:

اثر مهار کننده ها بر فعالیت انزیم

اثر PH بر فعالیت انزیمی

اثر دما بر فعالیت انزیم

آنزیم های اکثرا پروتئینی هستند و با کاهش انرژی فعال سازی واکنش های شیمیایی باعث افزایش سرعت واکنش می شوند و در آخر هم بدون مصرف باقی می مانند آنزیم ها کاتالیزورهای سیستم های بیولوژیکی هستند و  موجب تبدیل اشکال مختلف انرژی بهم دیگر می شوند.lاز مشخصّات قابل توّجه آنزیم ها قدرت کاتالیزوری بالا و اختصاصی بودن آنها بوده و بعلاوه فعّالیّت عدّه زیادی از آنزیم ها قابل تنظیم می باشد.تقریباً تمامی آنزیم های شناخته شده ، ساختمان پروتئینی دارند ولی کشف مولکولهای RNA فعّال از نظر کاتالیزوری نشان داد که فقط پروتئین ها نمی توانند کاتالیزورهای بیولوژیکی مطلق باشند

به استثنای ریبوزیم، همهٔ آنزیم های شناخته شده ، دارای ساختمان پروتئینی هستند. برخی آنزیم ها ، پروتئین های ساده بوده و مرکب از زنجیره های پلی پپتیدی هستند. مثالهایی از این نوع آنزیم ها ، آنزیم های هیدرولیتیک پپسین ، تریپسین  و … هستند

در 2 لوله ازمایش 5 سی سی نشاسته ی 1 درصد و 1 سی سی محلول امیلاز و 1 قطره معرف لوگل می افزاییم بعد در یکی از لوله ها 4 قطره نیترات جیوه دو ظرفیتی افزوده و بر روی لوله دارای انزیم مهار کننده را می نویسیم بعد هر دو  لوله ی ازمایش را به مدت 7 دقیقه در بن ماری 37 درجه گذاشته و بررسی مکنیم در حضور  فلز سنگین جیوه انزیم امیلاز باید به صورت برگشت ناپذیر مهار شود.

تئوری آزمایش

در 2 لوله ازمایش 5 سی سی نشاسته ی 1 درصد و 1 سی سی محلول امیلاز و 1 قطره معرف لوگل می افزاییم بعد در یکی از لوله ها 4 قطره نیترات جیوه دو ظرفیتی افزوده و بر روی لوله دارای انزیم مهار کننده را می نویسیم بعد هر دو  لوله ی ازمایش را به مدت 7 دقیقه در بن ماری 37 درجه گذاشته و بررسی مکنیم در حضور  فلز سنگین جیوه انزیم امیلاز باید به صورت برگشت ناپذیر مهار شود.

نتیجه

در نتیجه ی این ازمایش ید که معرف است رنگ زرد دارد و نشاسته که به عنوان سوبسترا عمل می کند بی رنگ است و محصول ما گلوگز بود.به ابن ترتیب اگر در لوله های از مایش انزیم الفا امیلاز اضافه کنیم و رنگ ابی بنفش ایجاد شود می فهمیم که انزیم عمل نکرده ولی اگر رنگ ابی بنفش ایجاد نشود پی بردیم که انزبم به خوبی عمل کرده است.